《样品准备储存与运输指南》

一、样本准备应该遵循的基本原则

代表性原则
取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。病变组织样本中应不夹带正常组织，正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时，应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。

准确性原则
代表性样本的各种特征数据必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。

迅速性原则
样本质量是表达谱芯片实验中影响实验结果的最关键因素，因此用于表达谱芯片研究的样本，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

低温原则
所取样本离体后，应立即置于液氮中，并保证在实验前始终处于-80℃以下，以避免RNA的降解。

二、样本采集、包装

样本采集、包装过程中的注意事项

1. 在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面，用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且不要与乙醇等有机溶剂接触。

2. 不要用纱布、纸张直接包裹样本，而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中。

3. 不要把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内，因为纸张在液氮中是易碎的。

4. 不要用玻璃容器在液氮中保存样本；样本包装中不要使用透明胶带。

5. 标签纸应该贴于样本袋绳上，不要贴于容器表面以免脱落造成样本混乱。

6. 不要在一只样本袋中放过多的样本，以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷

7. 客户在填写《样本登记单》时应当详细描述样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节，以便技术人员确定合理的实验方案。

三、样品储存与运输

样品储存

组织样品储存于液氮或超低温冰箱中。RNA样品储存于超低温冰箱中，在-200C冰箱保存时间不宜太久，最好及时反转录成cDNA后再在-200C冰箱储存。细胞样品经Trizol处理后储存于超低温冰箱中。在-200C冰箱中储存不宜太久。血液样品分离白细胞后用Trizol处理，然后储存于超低温冰箱中。

样品运输

样品运输建议采取液氮、干冰或者优冷公司干冰型低温冰袋保存下的超低温运输。

1、液氮运输

．液氮运输最好在人员监护下进行。长途应采用液氮罐，短途可采用保温杯。应保证液氮足够，以免运输过程中液氮挥发掉，影响材料质量。

．液氮为危险品，受到交通部门的管制。飞机运输应用空运型液氮罐，可以作为行李托运，不能随身携带。火车运输可用普通液氮罐，可随车托运，不能随身携带。托运时应有固定基座，以免倾倒，使液氮泄露。

．托运前应到学校保卫科或校办开具《非危险品证明》（非易燃易爆，无毒无害，无腐蚀），并加盖公章。

．液氮罐口较为狭小，所以放入的物品不易过大，以免无法取出。最好将样品放入编过号的冻存管中，再根据不同类别放入合适的小布袋，用线绳栓住，线绳另一端用布条做标记，拴在罐口提手上，以方便取出和分辨。

．冻存管应用进口高质量的冻存管，放入液氮前应拧紧，以免取出时发生炸裂伤人。

2、干冰运输

飞机运输干冰上限约为２公斤，超过２公斤原则上不能运输。

干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱，材料用编号后的冻存管存放，用塑料袋包装后埋入干冰中，泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装，以免碰裂。并标明轻取轻放提示，以保证安全运输。

干冰运输可委托当地快递公司，注意一定要确保48小时送达我方手中，不能送货上门的应提前通知我方。

２４小时到达的，干冰数量不得低于５公斤；４８小时到达的，干冰数量不得低于８公斤。夏季可以适当再多增加部分干冰（平时的1.5倍）。超过４８小时到达的，建议不要用此法运输。

运输时可在干冰上再放一排液体冰带。

如委托快递运输，运输过程中应随时跟踪货物的情况，记录货单号，并保持与发出地和接收地的快递公司的联系

3、ＲＮＡ运输

RNA运输须经乙醇(两倍体积)或异丙醇(等体积)沉淀,沉淀后的ＲＮＡ，可以用优冷干冰型超低温冰袋冰盒运输，但时间也不宜太久，以２４小时为限。未经沉淀的RNA应用干冰型低温冰袋或干冰或者液氮运输。

4、细胞及血液运输

细胞短距离可３７度培养瓶（细胞培养液）运输（24小时内）。长途运输可以Trizol处理后干冰型低温冰袋运输。

血液当地短距离可以加入抗凝剂（或直接用抗凝管乘后）后冰块运输（2小时），长途运输可先分离白细胞，Trizol处理后干冰或者优冷干冰型超低温冰袋运输。

5、优冷干冰型超低温冰袋运输

使用与储存十分方便
    与普通冰袋一样，使用前把“干冰型低温冰袋”放置在低温冰箱中冻结，配送前可以根据保温箱大小放置适量冻结好“干冰型低温冰袋”即可。不使用的“干冰型低温冰袋”可以在常温下保存以备下次使用。

安全方便
    使用过程中不会像干冰那样产生大量气体而存在安全隐患，因此，空运配送不受航空安全限制。

蓄冷量足，性价比高
    含冷量大，放冷速度慢，其保冷效果是相同质量干冰的2倍。综合使用成本为干冰的70%左右。

反复使用，安全可靠
    经过5000次反复充冷与放冷实验，蓄冷量衰减不超过3％；包装材料采用卫生无毒，抗寒坚实的尼龙复合材料，每个袋子都通过60kg压力检测与电子检漏测试，确保不会泄露污染药品或者食品。

卫生无毒
    该产品已经通过中国疾病预防控制中心与SGS等有关国内外检测机构的严格检测与认证，证明是安全无毒的产品。

四、其它保存样品的方式介绍

如果用液氮或干冰运输有困难,建议以干冰型超低温冰袋或者 RNAlater或RNAsecure保存样品进行运输,具体如下:

(一)RNAlater的使用方法

1. RNAlater的简介

• 产品描述 RNAlater是一种液态的，无毒的组织保存试剂。它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA于原位。获得组织块后，迅速浸泡在RNAlater中保存，而不会引起RNA的降解，这样可以不必马上处理样本或将样本冷冻在液氮之中以备以后处理。 RNAlater应保存在室温下，保质期6个月。如放置在4℃条件下则会引起沉淀，此时需加热到37℃才可澄清。 RNAlater可广泛应用于多种脊椎动物样本。包括脑、心、肾、脾、肝、睾丸、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。RNAlater对大肠杆菌、果蝇、组织培养细胞、全血细胞和一些植物也有效。
• RNAlater能否与RNA提取试剂盒兼容？ RNAlater可与大多数RNA提取方法相协调。特别是TRI Reagent?, RNAwiz, TōTALLY RNA, RNAqueous, and Poly(A)Pure。

2. 如何使用RNAlater RNAlater 只能用于新鲜组织，在浸入RNAlater之前不能冷冻组织。简单切碎组织样本，任何一边的最大厚度不能大于0.5cm, 然后将组织碎块放入到5倍体积的RNAlater中保存。

• 动物组织 RNAlater不会溶解或破坏组织样本的结构。如果需要的话，仍可将已经平衡在RNAlater溶液中的组织取出并分割成更小的块再重新放入到RNAlater中。小器官如鼠肝、肾和脾可以完整地保存在RNAlater中。
• 植物组织 许多植物组织可以简单浸泡在5倍体积的RNAlater中保存。具有自然屏障防止扩散的植物如蜡表皮的叶组织可能需要先破坏其屏障，以允许RNAlater进入组织
• 组织培养细胞 沉淀细胞，用PBS洗一次，再用少量的PBS悬浮细胞，然后加5~10倍体积的RNAlater保存。
• 白细胞 如果将白细胞从红细胞和血清中分离出来，并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在RNAlater中。不要将全血、血浆或血清中的RNA保存在RNAlater中，因为它们蛋白含量过高，与RNAlater混合后易形成不溶的沉淀。
• 细菌(以下内容是根据Ambion公司的产品说明书编译的，仅供参考)

RNAlater是抑菌的，虽然细菌在RNAlater中不能生长，但细胞仍保持其完整性。大肠杆菌保存在RNAlater中4℃条件下1个月仍很完整，产生不降解的RNA。

3. RNAlater中样品的保存

• 保存于-80℃ 建议用于批量保存。将样本在4℃条件下孵育过夜，然后从RNAlater溶液中取出样本保存于-80℃。对于组织培养细胞，不必移去RNAlater，只需简单冻存整个溶液。实验证明，细胞在-80℃条件下冻存于RNAlater溶液中并未出现溶解。样本可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA的质和量都不会受到影响。
• 保存于-20℃ 建议用于批量保存。将样本在4℃条件下孵育过夜，然后转移到-20℃。样本在-20℃条件下不会冻结，但在存贮缓冲液中会有结晶形成，这并不影响随后的RNA提取。样本可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA的质和量都不会受到影响。
• 保存于4℃ 厂家认为，目前尚无证据证明样本存于4℃1个月内会出现RNA降解。
• 如果没有冰箱： 将样本放在尽可能冷的环境中。如果周围温度超过25℃，应尽可能使RNAlater中的样本冰浴数小时。

4. RNAlater 中样本的RNA提取

• 组织 用消毒镊子将组织从存贮溶液RNAlater中取出，浸泡在RNA提取溶液中。一旦将组织放入RNA提取溶液中，匀浆一定要迅速进行。
• 细胞 从存贮在RNAlater中的细胞中提取RNA有两种操作方法可供选择：去除RNAlater或者从细胞与RNAlater的混合物中直接提取RNA。

5. 从RNAlater 中取出样品

• 去除RNAlater 因为RNAlater的浓度比典型的细胞培养介质的浓度高，因此用通常沉淀活细胞的离心力无法沉淀RNAlater中的细胞。离心沉淀细胞，去除RNAlater。（HeLa细胞大约需要3000×g，但其他细胞可能不能容忍这个速度，或者他们需要更大的离心力。）
• 从RNAlater中的细胞直接提取RNA 作为选择，我们可以用一步法破碎/提取溶液（如TRI Reagent和 RNAwiz　）从没有去除RNAlater的细胞中纯化RNA。这可通过向细胞混合物中加入10倍体积的一步提取溶液完成，其他照常。

(二)RNAsecure的使用方法

1. 简介：在分子生物学试剂中用Ambion公司的RNAsecure代替DEPC，有很多优点：

1) 可以加入到不能用DEPC处理的溶液中（如：Tris或MOPS缓冲液）；

2) 可以加入到不能被高压灭菌的溶液中；

3) 可以加入到加酶之前的酶促反应中。Ambion已经测试了有RNAsecure 试剂存在的如下酶促反应（先于酶加入）：RNA多聚酶T7，T3和SP6的体外转录（37℃），MMLV和AMV逆转录（42℃），以及SuperTaq PCR（94℃），均没有出现酶抑制现象。

2. 使用方法

1) 用缓冲液或经过处理的溶液稀释RNAsecure试剂到1×，充分混匀。

2) 将混合物在60℃水浴温浴20 min，冷却至室温。这样的溶液可备用于接下来的RNA提取和分析，或者保存于室温、4℃或-20℃以备将来使用。

3) 为了消除任何可能发生在经过初处理之后的RNA酶的污染，在使用前可以将RNAsecure溶液在60℃水浴中重新温浴10~20分钟。

3. 注意事项 RNAsecure 试剂只在高于45℃的条件下才有活性，但当反应体系孵育温度超过该温度时可能会使一些酶失活。因此，用RNAsecure处理反应缓冲液时要以加入酶之前做为临界点，然后进行酶促反应时孵育温度低于45℃。注意：这不适用于Taq 多聚酶。